Tiếng Việt 
日本語 (Japan) 
한국어 (Korean) 
中文 (Chinese) 
English (UK) 
Trong kỷ nguyên nghiên cứu nano và khoa học sự sống, việc quan sát mẫu ở trạng thái nguyên bản (native state) là một thách thức lớn do các mẫu "tươi" thường chứa hàm lượng nước cao và dễ bị phá hủy trong môi trường chân không của SEM truyền thống. Bài viết này phân tích giải pháp Cryo-SEM toàn diện, sự kết hợp giữa kính hiển vi Tescan Clara, hệ thống chuẩn bị mẫu Quorum PP3010 và bộ dò EDS Bruker XFlash 760 (thuộc dòng XFlash 7 thế hệ mới).
1. Cơ sở khoa học của phương pháp Cryo-SEM đối với mẫu tươi
Mẫu tươi, bao gồm các mô sinh học, thực phẩm, nhũ tương, và vật liệu pin ngậm nước, chứa một lượng lớn dung môi (thường là nước) bên trong cấu trúc mạng lưới phức tạp.Trong SEM truyền thống, quá trình chuẩn bị mẫu bao gồm các bước cố định hóa học, khử nước qua dãy ethanol và sấy điểm tới hạn (Critical Point Drying - CPD). Mặc dù CPD giúp giảm thiểu áp suất bề mặt trong quá trình sấy, nó vẫn gây ra sự thay đổi đáng kể về mặt hóa sinh và cơ học, chẳng hạn như làm mất đi các thành phần hòa tan hoặc làm biến đổi các sợi protein mỏng manh.
Kỹ thuật Cryo-SEM thay đổi hoàn toàn cách tiếp cận này bằng cách sử dụng quá trình thủy tinh hóa (vitrification).Bằng cách làm lạnh mẫu với tốc độ cực nhanh (thường > 10,000 K/giây), nước trong mẫu chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn vô định hình (băng thủy tinh) mà không kịp hình thành các tinh thể đá.Việc tránh hình thành tinh thể đá là cực kỳ quan trọng vì sự giãn nở của đá tinh thể có thể làm rách màng tế bào và phá hủy các cấu trúc nội bào tinh vi.Hệ thống Quorum PP3010 đóng vai trò trung tâm trong quá trình này bằng cách cung cấp trạm làm lạnh nitơ sệt (slushy nitrogen), giúp đạt được tốc độ truyền nhiệt tối ưu để bảo tồn cấu trúc mẫu gần với trạng thái tự nhiên nhất.
2. Quorum PP3010: Hệ sinh thái chuẩn bị mẫu Cryo chuyên dụng
• Đông lạnh cực nhanh: Tại trạm Prepdek®, mẫu được nhúng vào nitơ lỏng sệt (slushy nitrogen) ở nhiệt độ khoảng −210∘C, giúp tốc độ làm lạnh vượt qua điểm hình thành tinh thể đá, giữ cho nước ở trạng thái rắn vô định hình để không làm rách màng tế bào.
• Xử lý trong buồng aQuilo®: Buồng chuẩn bị gắn trực tiếp lên cột SEM, cho phép thực hiện các thao tác:
◦ Bẻ gãy lạnh (Cold Fracturing): Bộc lộ cấu trúc nội bào theo các ranh giới tự nhiên mà không gây biến dạng cơ học.
◦ Thăng hoa có kiểm soát (Sublimation): Tăng nhẹ nhiệt độ (thường lên −90∘C) để loại bỏ lớp băng bề mặt, làm lộ ra các chi tiết nano bị ẩn giấu.
◦ Phủ Platinum (Pt) độ phân giải cao: Sử dụng magnetron lạnh để tạo lớp phủ dẫn điện siêu mịn, hỗ trợ chụp ảnh ở độ phóng đại trên 100,000x.
• Vận hành chống rung: PP3010 sử dụng khí nitơ lạnh để điều nhiệt thay vì nitơ lỏng đang sôi, giúp loại bỏ rung động cơ học và duy trì độ ổn định nhiệt độ ±0.5∘C trong hơn 24 giờ.
3. Tescan Clara: "Mắt thần" UHR-SEM tối ưu cho mẫu nhạy cảm
Tescan Clara là hệ thống FEG-SEM độ phân giải siêu cao, được thiết kế với cột điện tử BrightBeam™ không từ trường (field-free), cực kỳ lý tưởng cho các mẫu Cryo nhạy cảm.
• Hiệu năng ở điện áp thấp (Low-kV): Để tránh làm tan chảy bề mặt băng hoặc tích điện, Clara cho phép chụp ảnh ở mức năng lượng cực thấp với độ phân giải ấn tượng: 1.2 nm tại 1 kV khi sử dụng công nghệ giảm tốc chùm tia (BDT).
• Hệ thống đầu dò đa kênh: Các đầu dò trong cột như Multidetector và Axial detector có khả năng lọc năng lượng và góc tán xạ, giúp tách biệt thông tin địa hình bề mặt và tương phản thành phần hóa học.
• Tự động hóa In-Flight™: Tự động căn chỉnh chùm tia và lấy nét trong thời gian thực, giúp giảm thiểu thời gian mẫu tiếp xúc với chùm electron, bảo vệ tính toàn vẹn của cấu trúc sinh học.
4. Bruker EDS XFlash 760: Giải mã thành phần hóa học ở nhiệt độ âm
• Tốc độ và Độ chính xác: XFlash 760 cung cấp tốc độ đếm đầu ra (OCR) lên tới 2,700 kcps và độ phân giải năng lượng cực tốt (<129 eV tại Mn Kα). Điều này cho phép thu thập bản đồ nguyên tố cực nhanh (Chemical Snapshot) trước khi mẫu bị nhiễm bẩn băng.
• Khả năng phát hiện nguyên tố nhẹ: Cửa sổ đầu dò SLEW cho phép nhận diện các nguyên tố từ Beryllium (4) trở đi, rất quan trọng trong phân tích các mẫu sinh học và vật liệu pin.
• Thiết kế FlatQUAD (Tùy chọn nâng cao): Trong các cấu hình Cryo-SEM khắt khe, bộ dò FlatQUAD dạng hình nhẫn với góc khối siêu lớn (1.1 sr) thường được ưu tiên để thu tín hiệu ở dòng chùm tia cực thấp (<50 pA), đồng thời loại bỏ hiện tượng bóng mờ trên các bề mặt mẫu bẻ gãy gồ ghề.
5. Quy trình vận hành tích hợp cho kết quả tối ưu
Sự phối hợp nhịp nhàng giữa Tescan, Quorum và Bruker đòi hỏi một quy trình vận hành được chuẩn hóa để đảm bảo tính toàn vẹn của mẫu và độ chính xác của dữ liệu.
1. Chuẩn bị mẫu tươi: Mẫu được đặt lên giá đỡ phù hợp (ví dụ: giá đỡ dạng kẹp cho mô thực vật hoặc giá đỡ dạng đĩa cho dịch lỏng).
2. Đông lạnh nhanh: Sử dụng trạm Prepdek® để thủy tinh hóa mẫu trong nitơ sệt. Bước này thường chỉ mất vài giây nhưng quyết định toàn bộ chất lượng hình ảnh cryo.
3. Chuyển mẫu và bẻ gãy: Mẫu được chuyển vào buồng aQuilo® dưới chân không. Tại đây, người dùng thực hiện bẻ gãy mẫu bằng dao bẻ gãy tích hợp để lộ ra các cấu trúc nội tại.
4. Thăng hoa và phủ mẫu: Tùy thuộc vào yêu cầu, mẫu có thể được thăng hoa nhẹ để làm nổi bật cấu trúc và sau đó phủ một lớp Pt mỏng (2-5 nm) để tăng độ tương phản và khả năng dẫn điện.
5. Quan sát và Phân tích: Mẫu được chuyển sang stage lạnh của Tescan Clara (duy trì ở −140∘C đến −190∘C).[8] Sử dụng phần mềm Tescan Essence™ để điều hướng và tìm kiếm khu vực quan tâm, sau đó kích hoạt bộ dò Bruker để thu thập bản đồ nguyên tố.
6. Các ứng dụng tiêu biểu trong nghiên cứu và công nghiệp
Sự kết hợp giữa Tescan Clara, Quorum PP3010 và Bruker EDS đã mở ra những hướng đi mới trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau.
Khoa học pin và vật liệu năng lượng
Trong nghiên cứu pin lithium-ion, việc hiểu rõ cấu trúc và thành phần của lớp giao diện điện phân rắn (SEI) là cực kỳ quan trọng. SEI là một lớp rất mỏng và cực kỳ nhạy cảm với không khí cũng như chùm tia electron.
- Hệ thống Cryo-SEM cho phép giữ cho các chất điện phân lỏng ở trạng thái đông lạnh, ngăn chặn sự bay hơi và giữ nguyên cấu trúc của SEI.
- Tescan Clara với độ phân giải siêu cao tại điện áp thấp giúp quan sát các vết nứt nano trên hạt điện cực.
- Bruker EDS giúp lập bản đồ phân bố các nguyên tố nhẹ như Fluorine, Phosphorus và Carbon trong SEI, từ đó làm sáng tỏ cơ chế suy yếu của pin sau nhiều chu kỳ sạc xả.
Khoa học sự sống và sinh học thực vật
Cryo-SEM là tiêu chuẩn vàng để quan sát các mẫu thực vật và mô động vật nhạy cảm.
- Các nhà nghiên cứu đã sử dụng hệ thống này để nghiên cứu đỉnh sinh trưởng của Arabidopsis thaliana, một loại mẫu cực kỳ dễ bị khô héo và hư hại dưới SEM thông thường.
- Trong nghiên cứu tơ tằm, Bruker FlatQUAD đã được sử dụng để lập bản đồ sự phân bố của các ion kim loại trong tuyến tơ của tằm, cung cấp thông tin quý giá về quá trình tiến hóa và hình thành sợi tơ ở cấp độ phân tử. Việc này không thể thực hiện được bằng các phương pháp sấy khô vì các ion kim loại sẽ bị di chuyển hoặc mất đi trong quá trình khử nước.
Ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm
Thực phẩm như kem (ice cream), sữa chua hoặc các loại kem dưỡng da mỹ phẩm là các hệ nhũ tương và bọt phức tạp.
- Cryo-SEM cho phép quan sát trực tiếp các hạt béo, bọt khí và tinh thể đá trong kem mà không làm tan chảy chúng.
- PP3010 giúp bảo tồn cấu trúc của các hydrogel và oleogel nhạy cảm, cho phép nghiên cứu sự phân bố của các thành phần hoạt tính bên trong mạng lưới gel.
- Tescan Clara cung cấp hình ảnh độ phân giải nano của các ranh giới pha, giúp các nhà khoa học thực phẩm tối ưu hóa công thức để cải thiện độ mịn và thời hạn sử dụng của sản phẩm.
7. Sự tương tác hệ thống và quy trình vận hành tích hợp
Sự thành công của một thử nghiệm Cryo-SEM không chỉ đến từ việc sở hữu các thiết bị riêng lẻ mà còn từ sự tương thích hoàn hảo giữa chúng.
Sự ổn định nhiệt và cơ học
Để thực hiện các phép đo EDS kéo dài hoặc chụp ảnh độ phân giải cao, sự ổn định của stage lạnh bên trong SEM là yếu tố sống còn. Hệ thống làm lạnh của Quorum sử dụng khí nitơ lạnh (vibration-free) thay vì nitơ lỏng đang sôi, giúp loại bỏ hoàn toàn các rung động cơ học có thể làm nhòe hình ảnh ở độ phóng đại lớn.Độ ổn định nhiệt độ đạt mức ±0.5∘C đảm bảo rằng mẫu không bị tái kết tinh đá (recrystallization) trong suốt quá trình phân tích.
Tích hợp phần mềm và tự động hóa
Phần mềm Tescan Essence™ tích hợp mô hình va chạm 3D trực tiếp trong buồng mẫu, điều này cực kỳ quan trọng khi làm việc với stage cryo và các bộ dò nhạy cảm như FlatQUAD. Khi mẫu di chuyển, phần mềm sẽ tự động tính toán khoảng cách an toàn để tránh va chạm giữa stage lạnh và bộ dò tia X vốn được đặt rất gần mẫu.Sự kết hợp giữa In-Flight Beam Tracing™ của Tescan và các chế độ tự động của Bruker ESPRIT giúp người dùng nhanh chóng đạt được các điều kiện chùm tia tối ưu cho cả hiển vi hình thái và phân tích hóa học.
8. Những lưu ý kỹ thuật khi phân tích mẫu tươi bằng Cryo-SEM-EDS
Mặc dù hệ thống cung cấp những khả năng mạnh mẽ, người dùng cần lưu ý một số yếu tố kỹ thuật để đạt được kết quả chính xác nhất.
1. Kiểm soát nhiễm bẩn băng (Ice Contamination): Ngay cả trong chân không cao, các phân tử nước dư thừa vẫn có thể ngưng tụ lên bề mặt mẫu lạnh, tạo thành các hạt tuyết nhỏ. Hệ thống bẫy lạnh (cold trap/anti-contaminator) trong cả buồng chuẩn bị và buồng SEM của Quorum phải được duy trì ở nhiệt độ thấp hơn mẫu ít nhất 10−20∘C để thu hút các phân tử nước này, giữ cho bề mặt mẫu luôn sạch.
2. Lựa chọn điện áp gia tốc tối ưu: Để phân tích EDS, điện áp gia tốc cần phải đủ cao để kích thích các vạch tia X đặc trưng nhưng cũng phải đủ thấp để giữ cho thể tích tương tác (interaction volume) nằm trong lớp bề mặt mẫu cryo mỏng. Thông thường, mức điện áp 3-5 kV là sự cân bằng tốt cho các mẫu sinh học khi sử dụng bộ dò FlatQUAD.
3. Độ dày lớp phủ: Một lớp phủ quá dày (ví dụ > 10 nm) có thể che lấp các chi tiết nano của bề mặt mẫu, nhưng một lớp phủ quá mỏng có thể không đủ để dẫn điện, gây ra hiện tượng nạp điện làm lệch chùm tia electron.Quorum PP3010 cho phép người dùng kiểm soát độ dày lớp phủ với độ chính xác mức angstrom thông qua bộ giám sát độ dày màng mỏng (FTM) tùy chọn.
9. Tầm nhìn tương lai và sự phát triển của công nghệ
Giải pháp tích hợp Tescan Clara, Quorum PP3010 và Bruker EDS đang mở đường cho các nghiên cứu đa phương thức (multimodal) và tương quan (correlative imaging). Ví dụ, việc kết hợp Cryo-SEM với phổ Raman (TESCAN RISE) cho phép phân tích đồng thời cấu trúc nano, thành phần nguyên tố và các liên kết hóa học của mẫu ở trạng thái đông lạnh.
Hơn nữa, sự phát triển của các hệ thống chùm ion tập trung (FIB) đông lạnh như Tescan Amber hay Solaris X2, kết hợp với các quy trình cryo của Quorum, cho phép các nhà khoa học chuẩn bị các lá mẫu (lamella) siêu mỏng từ các tế bào tươi để phân tích sâu hơn bằng kính hiển vi điện tử truyền dẫn đông lạnh (Cryo-TEM). Đây là một bước tiến quan trọng trong sinh học cấu trúc, giúp hiểu rõ hơn về vị trí và chức năng của các protein bên trong môi trường tế bào nguyên bản.
Kết luận
Liên hệ & Tư vấn chi tiết
