Phỏng vấn | “Phần khó nhất là tìm đúng vị trí trên mẫu.” FIB-SEM mở rộng quy trình cryo-FIB trong lĩnh vực khoa học sự sống

Hỏi: Chúng ta đang ngồi trong phòng thí nghiệm Core Facility hiện đại của các bạn. Chính xác thì điều đó có nghĩa là gì?

Dominik Pinkas:

Chúng tôi hoạt động hoàn toàn theo mô hình cơ sở nghiên cứu theo hợp đồng (contract research facility) — phòng thí nghiệm của chúng tôi là một cơ sở hạ tầng nghiên cứu dùng chung thuộc hạ tầng quốc gia Czech-BioImaging và mạng lưới Euro-BioImaging của châu Âu. Cơ sở gồm bốn chuyên gia, do TS. Vlada Filimonenko phụ trách, và được trang bị một danh mục thiết bị toàn diện, tập trung quanh ba hệ thống chính: hai kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và một kính hiển vi điện tử quét kết hợp chùm ion hội tụ (FIB-SEM).

Markéta Dalecká:

Nhiệm vụ chính của chúng tôi là hỗ trợ cộng đồng học thuật, để các nhóm nghiên cứu riêng lẻ không cần phải đầu tư vào thiết bị kính hiển vi của riêng mình. Nhiều nhà nghiên cứu chỉ cần thực hiện tạo ảnh định kỳ, nên việc duy trì các thiết bị đắt tiền là không thực tế. Đồng thời, chúng tôi cũng làm việc với một số lượng đáng kể khách hàng công nghiệp, những đơn vị cần kính hiển vi độ phân giải cao để kiểm chứng sản phẩm và xác nhận liệu chúng có đáp ứng các thông số kỹ thuật được công bố hay không.

Hỏi: FIB-SEM là thiết bị mới nhất được bổ sung vào hệ thống thiết bị của các bạn. Nó đã đến với phòng thí nghiệm như thế nào?

Dominik Pinkas:

Trước khi mua kính hiển vi này, cơ sở của chúng tôi hoàn toàn không có hệ thống FIB-SEM. Toàn bộ câu chuyện bắt đầu từ việc Tescan cho chúng tôi mượn một thiết bị giống hệt, trong thời gian đó chúng tôi đã làm việc chặt chẽ với bộ phận R&D của họ.

Sự hợp tác này thực sự mang lại lợi ích cho cả hai bên. Đối với phòng thí nghiệm của chúng tôi, đây là một cơ hội đặc biệt để mở rộng danh mục các kỹ thuật kính hiển vi tiên tiến mà không cần phải đầu tư một khoản chi phí ban đầu lớn. Đối với Tescan, sự hợp tác này mang lại khả năng tiếp cận trực tiếp với một phòng thí nghiệm dịch vụ trong môi trường thực tế, nơi các nhà phát triển có thể quan sát cách kính hiển vi của họ hoạt động trong các ứng dụng sinh học đầy thách thức và cách thiết bị tích hợp với các quy trình chuẩn bị mẫu trước và sau đó.

Trong suốt giai đoạn đánh giá này, hai đội ngũ đã kết hợp chuyên môn của mình. Công việc vượt xa việc đơn thuần thử nghiệm một thiết bị mới. Ngay từ đầu, các nhà nghiên cứu của IMG và Tescan đã cùng nhau phát triển những phương pháp hoàn toàn mới — trong đó có quy trình cryo lift-out độc đáo — đồng thời đánh giá các nguyên mẫu đầu tiên của cryo nanomanipulator và khả năng tích hợp với kính hiển vi huỳnh quang.

Hỏi: Trách nhiệm của hai bạn được phân chia như thế nào?

Markéta Dalecká:

Đối với tôi, FIB-SEM trước hết là một nền tảng tạo ảnh. Trọng tâm chính của tôi là chụp cắt lớp FIB nối tiếp (serial FIB tomography). Chúng tôi phay đi một lớp vật liệu cực kỳ mỏng — thông thường khoảng 5 nanomet — tạo ảnh bề mặt vừa được làm lộ ra, sau đó lặp lại quá trình này. Bằng cách luân phiên giữa phay và tạo ảnh, chúng tôi tái dựng thể tích mẫu trong không gian ba chiều.

Bởi vì Dominik và tôi sử dụng kính hiển vi cho những mục đích khác nhau và có chuyên môn bổ trợ cho nhau, chúng tôi có thể khai thác gần như toàn bộ tiềm năng của thiết bị.

Dominik Pinkas:

Nền tảng chuyên môn của tôi là kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Trong nhiều năm, tôi không xem FIB-SEM là một kính hiển vi theo nghĩa truyền thống. Thay vào đó, nó đóng vai trò như một công cụ chuẩn bị mẫu có độ chính xác đặc biệt cao cho lamella TEM. Kính hiển vi điện tử truyền qua yêu cầu các mẫu siêu mỏng, cho phép electron truyền qua mẫu.

Chỉ sau khi Markéta gia nhập phòng thí nghiệm, chúng tôi mới bắt đầu khai thác đầy đủ khả năng tạo ảnh của FIB-SEM, qua đó mở rộng đáng kể phạm vi nghiên cứu của mình.

Hỏi: Tại sao các bạn lại lựa chọn cấu hình detector và công nghệ cụ thể này?

Dominik Pinkas:

Chùm ion gallium (Ga-FIB) và khả năng tích hợp cryo nanomanipulator là những yếu tố mang tính quyết định. Mặc dù các hệ thống plasma FIB có ưu thế trong việc loại bỏ nhanh chóng các thể tích vật liệu lớn, gallium vẫn chưa có đối thủ trong việc chuẩn bị các cấu trúc nano sinh học tinh vi, bởi nó tạo ra biên dạng chùm tia mảnh hơn nhiều.

Markéta Dalecká:

Nhờ nguyên mẫu cryo nanomanipulator thế hệ thứ hai của Tescan, chúng tôi đã có thể thực hiện cryo lift-out đầu tiên tại Cộng hòa Séc. Chúng tôi có thể lấy ra một thể tích mẫu đông lạnh được định vị chính xác từ vật liệu sinh học, gắn nó lên một lưới TEM bằng phương pháp tái lắng đọng đồng được phún xạ trong điều kiện cryogenic, sau đó phân tích mẫu bằng TEM trong khi vẫn duy trì mẫu ở trạng thái nguyên bản được thủy tinh hóa hoàn toàn (fully vitrified).

Hỏi: Những thành tựu nghiên cứu nào nổi bật nhất trong ký ức của các bạn?

Markéta Dalecká:

Một trong những dự án tôi yêu thích nhất liên quan đến các tế bào bị nhiễm vi khuẩn, khiến mạng lưới ty thể bị tái cấu trúc mạnh mẽ. Kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rõ những thay đổi lớn về cấu trúc, nhưng độ phân giải không đủ để hiểu chính xác điều gì đang xảy ra.

Sử dụng chụp cắt lớp FIB-SEM (FIB-SEM tomography), chúng tôi đã tái dựng toàn bộ mạng lưới ty thể trong không gian ba chiều. Sau đó, chúng tôi tương quan những dữ liệu này với các hình ảnh huỳnh quang thu được từ các tế bào sống. Kết quả cho thấy những cấu trúc giống túi bị tổn thương — không còn mang hình dạng giống ty thể — thực chất là phần còn lại của các ty thể. Nếu không có phương pháp tạo ảnh tương quan, chúng tôi sẽ không thể đưa ra kết luận đó với độ tin cậy như vậy.

Dominik Pinkas:

Đối với tôi, đó là một dự án liên quan đến Caenorhabditis elegans. Chúng tôi cần cô lập một cấu trúc chỉ có kích thước vài trăm nanomet bên trong một nhân tế bào cụ thể, trong khi trong toàn bộ cơ thể sinh vật chỉ có một số lượng rất ít những cấu trúc như vậy.

Bằng cách sử dụng định vị có dẫn hướng bằng huỳnh quang được tích hợp vào phần mềm của kính hiển vi, chúng tôi đã xác định thành công nhân tế bào mục tiêu, chuẩn bị một lamella cryogenic và chuyển nó vào TEM. Toàn bộ quy trình vẫn được duy trì trong điều kiện cryogenic. Theo hiểu biết của chúng tôi, trước đó chưa có ai chuẩn bị và tạo ảnh một mẫu như vậy với mức độ chính xác này.

Hỏi: Các bạn đánh giá giao diện người dùng và phần mềm như thế nào so với những hệ thống trước đây?

Markéta Dalecká:

Tôi đã chuyển từ các hệ thống của đối thủ sang Tescan, và phải nói rằng giao diện người dùng rất xuất sắc. Nó đơn giản hơn, trực quan hơn và có khả năng tùy biến cao. Mỗi người vận hành có thể tùy chỉnh bố cục theo quy trình làm việc của mình. Hệ thống Help được tích hợp cũng cực kỳ hữu ích.

Dominik Pinkas:

Một ưu điểm lớn khác là Tescan sẵn sàng hợp tác trực tiếp với người dùng. Không giống như các tập đoàn đa quốc gia lớn, chúng tôi có thể trao đổi trực tiếp với các nhà phát triển phần mềm. Trước đây, các chức năng tự động — chẳng hạn như lấy nét tự động (autofocus) — từng gây ra một số thách thức. Tuy nhiên, sau quá trình hợp tác và thử nghiệm chuyên sâu các phiên bản đang được phát triển, khả năng tự động hóa hiện đã đạt đến mức có thể tin cậy trong quá trình vận hành thường quy.

Hỏi: Những thách thức công nghệ lớn nhất khi tạo ảnh các mẫu sinh học là gì?

Dominik Pinkas:

Thách thức lớn nhất là độ nhạy cực cao của vật liệu sinh học đối với chùm tia. Mỗi electron được sử dụng để tạo ảnh đều không thể tránh khỏi gây tổn thương cho mẫu. Chùm electron phá vỡ các liên kết hóa học, tạo ra sự gia nhiệt cục bộ và kích hoạt các phân tử khí còn dư bên trong buồng kính hiển vi. Những phân tử này sau đó lắng đọng lên bề mặt mẫu, tạo ra hiện tượng nhiễm bẩn ngay tại vị trí chùm tia hội tụ.

Do đó, mục tiêu cuối cùng của chúng tôi là giảm thiểu tổn thương do bức xạ trong khi vẫn thu được thông tin cấu trúc có ý nghĩa.

Markéta Dalecká:

Đó chính xác là lý do tại sao chúng tôi tránh chiếu chùm tia vào mẫu bất cứ khi nào có thể. Chùm tia được blank trong quá trình định vị và căn chỉnh. Chúng tôi chỉ chiếu sáng mẫu trong thời gian rất ngắn để xác nhận vị trí, sau đó ngay lập tức blank chùm tia trở lại.

Tương tự, việc lấy nét được thực hiện ở ngoài vùng quan tâm, bởi các electron năng lượng cao có thể gây tổn thương vĩnh viễn cho mẫu, đặc biệt ở độ phóng đại cao, khi vùng bị chiếu xạ trở nên dễ nhận thấy.

Hỏi: Một chủ đề quan trọng khác là lựa chọn giữa mẫu nhúng nhựa resin và mẫu cryogenic. Những đánh đổi này ảnh hưởng như thế nào đến công việc của các bạn?

Markéta Dalecká:

Kính hiển vi điện tử luôn là vấn đề của những sự đánh đổi. Mỗi ưu điểm đều đi kèm với một cái giá nhất định. Phương pháp nhúng nhựa resin truyền thống chắc chắn làm thay đổi siêu cấu trúc nguyên bản thông qua quá trình khử nước, nhưng lại mang đến độ tương phản hình ảnh rất tốt vì các kim loại nặng có thể được đưa vào mẫu bằng phương pháp hóa học.

Dominik Pinkas:

Quy trình chuẩn bị cryogenic nhanh hơn đáng kể vì mẫu gần như được thủy tinh hóa (vitrified) ngay lập tức, cho phép các bước xử lý tiếp theo được thực hiện ngay sau đó. Quá trình đông lạnh nhanh dưới áp suất cao ngăn ngừa sự hình thành tinh thể băng, tạo ra băng thủy tinh (vitreous ice) có mật độ về cơ bản tương đương với nước ở trạng thái lỏng.

Tuy nhiên, các mẫu cryogenic có độ tương phản nội tại thấp hơn nhiều và cực kỳ nhạy cảm với tổn thương do nhiệt.

Hỏi: Chuyển mẫu cryogenic vốn nổi tiếng là một công đoạn đầy thách thức. Các bạn có thấy những bước phát triển công nghệ nào có thể loại bỏ công đoạn này không?

Dominik Pinkas:

Không thể phủ nhận rằng chuyển mẫu cryogenic là công đoạn quan trọng và then chốt nhất trong toàn bộ quy trình. Vào mùa hè, khi độ ẩm trong phòng thí nghiệm đạt khoảng 58%, các mẫu cryogenic ngay lập tức bị tích tụ sương giá. Điều kiện vào mùa đông thuận lợi hơn nhiều vì độ ẩm thấp hơn giúp giảm đáng kể hiện tượng nhiễm băng.

Bất cứ khi nào một mẫu cryogenic tiếp xúc với không khí môi trường xung quanh tại khu vực thao tác với nitơ lỏng, nguy cơ nhiễm bẩn đều trở nên nghiêm trọng.

May mắn thay, hiện tại chúng tôi đang trong quá trình trang bị một kính hiển vi huỳnh quang được tích hợp trực tiếp vào buồng của kính hiển vi điện tử. Điều này sẽ loại bỏ hoàn toàn công đoạn chuyển mẫu có nhiều rủi ro này.

Hỏi: Bạn kỳ vọng việc tích hợp in-situ này sẽ tác động như thế nào đến quy trình làm việc hằng ngày?

Markéta Dalecká:

Lợi ích lớn nhất sẽ là đơn giản hóa đáng kể việc xác định các vùng quan tâm (ROI). Khả năng định vị có dẫn hướng bằng huỳnh quang (fluorescence-guided navigation), vốn đã được tích hợp rất tốt trong phần mềm Tescan, sẽ cho phép chúng tôi xác định chính xác và kiểm tra các cấu trúc mục tiêu ngay bên trong kính hiển vi.

Tôi thực sự tin rằng các cơ sở nghiên cứu dùng chung (core facilities) nên hợp tác chặt chẽ với nhau. Giải pháp tích hợp này sẽ kết hợp liền mạch kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi điện tử thành một quy trình duy nhất, mà không cần phải thực hiện các bước chuyển mẫu đầy rủi ro giữa các phòng thí nghiệm hoặc thậm chí giữa các tầng khác nhau của tòa nhà.

Xin cảm ơn các bạn về cuộc phỏng vấn, và chúc các bạn tiếp tục đạt được nhiều thành công trong nghiên cứu.

Biên soạn bởi Jana Šilarová
Trưởng Bộ phận Marketing

Source: https://tescan.com/news/materials-science-electron-microscopy-university-zilina?ct

Chi tiết sản phẩm: -